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科研服务
Single cell sequencing
单细胞测序
单细胞测序-10X Chromium 单细胞转录组测序

1、产品介绍


细胞是生物活动的基本功能单位,也是生命科学的核心研究对象。生物机体的组织由多种类型的细胞组成,每种细胞类型都有不同的谱系和独特的功能,对组织和器官生物学产生影响,并最终定义机体整体的生物学功能。每个细胞的谱系和发育阶段决定细胞如何对其他细胞和微环境产生应答。此外,由于随时间产生的随机变化,同类型细胞的亚群之间以及它们与其他细胞类型之间通常具有遗传异质性。若想通过分析大量组织或细胞来深入了解机体的这种复杂性是很困难的,这就突显出分离单细胞进行研究的必要性。

单细胞转录组测序指的是在单个细胞水平上研究基因表达的一项技术,其主要技术原理是每个分离得到的单细胞内包含的微量 mRNA 通过高效扩增后再进行测序,因此单细胞转录组测序可以有效解决细胞异质性问题,有助于细分细胞亚群并发现新的细胞类型,了解细胞发育和分化的调控机制等。

真正单细胞测序:10x genomics 技术原理类似于 Drop-seq,平台利用微流体“双十字”交叉系统分选单个细胞,通过 barcode 磁珠-单细胞-油滴的对应关系形成 GEM(Gel Beads-in emulsion),实现真正意义上的单细胞测序。

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2、应用领域


1. 组织器官大规模细胞图谱构建;

2. 细胞分型细化 & 稀有细胞类型鉴定;

3. 贝博手机登陆网页方向研究 :a) 贝博手机登陆网页细胞异质性,b) 贝博手机登陆网页微环境,c) 贝博手机登陆网页免疫反应,d) 贝博手机登陆网页进化,e) 细胞受体,配体间相互作用,f) 贝博手机登陆网页耐药性,g) 贝博手机登陆网页干细胞分化;

4. 干细胞发育及分化研究;

5. 免疫研究:a) 构建免疫图谱,b) 免疫细胞分化,c) 免疫治疗;

6. 生物标志物挖掘


3、案例分析


案例 1:利用空间组学技术解析人结直肠癌中的多细胞免疫中心


研究背景:

在结直肠癌中,错配修复缺陷型(MMRd)贝博手机登陆网页比错配修复完整型(MMRp)贝博手机登陆网页表现出更强的抗贝博手机登陆网页免疫能力。为了了解不同反应的规律,作者采用单细胞和空间组学技术相结合的方法对此进行了解析。

研究思路:

作者从 28 个 MMRp 和 34 个 MMRd 个体的大肠贝博手机登陆网页和 36 个邻近正常组织中转录分析了 371,223 个细胞。对 88 个细胞亚群及其 204 个相关基因表达程序的分析显示,结直肠癌中存在广泛的转录和空间重构。为了进一步发现相互作用的恶性细胞和免疫细胞的枢纽,作者确定了不同细胞类型的表达程序,这些程序在受影响个体的贝博手机登陆网页中存在共同变化,并使用空间图谱来定位协同程序。同时,在贝博手机登陆网页-管腔界面发现了一个与组织损伤相关的髓系细胞吸引中心,以及贝博手机登陆网页内 MMRd 富集的免疫中心,这个免疫中心包含了活化的 T 细胞以及表达了趋化因子的恶性贝博手机登陆网页细胞和髓样细胞。

研究结果:

本研究提供了一个相对较大的肠癌患者数据集,进行了包括细胞状态、基因程序及其在贝博手机登陆网页中的转化(如在间质细胞中观察到的深刻变化)。作者基于基因程序的共同变异对几个多细胞中心进行预测,随后进行两个免疫-恶性中心(hub 区域)的空间定位,将大量的细胞状态和程序组成较少数量的细胞和过程的协调网络。了解这些中枢的分子机制并研究它们在治疗过程中的时间和空间调节对于推进癌症治疗至关重要。

Karin Pelka, et al. Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer, Cell, Volume 184, Issue 18, 2021, Pages 4734-4752.e20,https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.08.003.

影响因子:41.582


案例 2:DSP 联合单细胞解析滑膜肉瘤贝博手机登陆网页免疫微环境


研究背景:

滑膜肉瘤是一种由 SS18-SSX 基因融合驱动的恶性贝博手机登陆网页。该贝博手机登陆网页的一个特点是贝博手机登陆网页免疫微环境中极低的 T 细胞浸润程度,因此目前在贝博手机登陆网页治疗领域大展身手的免疫疗法在此处也不免折戟。基于滑膜肉瘤的含碱性组织特性,目前关于滑膜肉瘤的基因组学和分子致病机理研究依然依赖于少部分样本的大块组织进行分析,因此医学界对于其中贝博手机登陆网页异质性和免疫微环境的了解少之又少。如何通过深入了解滑膜肉瘤中贝博手机登陆网页细胞群落和免疫细胞贫乏的原因对于将来在该疾病中让更多病人收益于免疫疗法有着深远的意义。

研究思路:

1. 单细胞测序对 12 个滑膜肉瘤的 16,872 个细胞进行了分析并提取了贝博手机登陆网页细胞富集的核心驱动基因标记,可区分上皮和间质细胞(mRNA/CNV/关键融合基因检测SS18-SSX1/SS18-SSX2)

2. 原位免疫荧光检测验证核心驱动基因 KM 生存分析(HSP90、c-Jun、EGR1、LGALS1、E-cad、Vimentin)

3. 通过 DSP 技术,对 9 例患者 FFPE 样本中的贝博手机登陆网页细胞和免疫细胞进行空间转录组的分析(CTA),2 例开展 WTA 分析,形态学试剂为 CD45、panCK 及核染;

研究结果:

核心驱动基因 signature 主要集中在 TNF 信号通路、p53 信号通路以及细胞凋亡的抑制,说明该基因集在免疫抑制和贝博手机登陆网页细胞增殖方面可能有着重要作用。应用核心基因集对大样本量滑膜肉瘤病人进行生存分析验证,发现该标记主要集中于分化更差、远端转移以及出现复发的病人当中,这一发现对于指导病人预后具有极大的临床意义。NanoString 的 GeoMx Digital Spatial Profiler 平台分析结果表明,核心驱动基因标记在组织空间中的分布与免疫细胞的浸润呈现出负相关的关系,贝博手机登陆网页细胞中的核心驱动基因标记越是富集,周围的免疫细胞浸润越低,说明该核心驱动基因直接抑制了 T 细胞的浸润,令本来具有抗贝博手机登陆网页活性的 CD8 T 细胞无法消灭这些贝博手机登陆网页细胞。

Jerby-Arnon L, et al. Opposing immune and genetic mechanisms shape oncogenic programs in synovial sarcoma. Nat Med. 2021 Feb;27(2):289-300. doi:10.1038/s41591-020-01212-6. Epub 2021 Jan 25. PMID: 33495604.

影响因子:28.547

 

4、常见问题


Q1.通常样品 nGene 和 nUMI 的相关性系数要在 0.8 以上,但是这次实验的相关性在 0.5以下,怎么解释这个情况,得到的实验下机数据还可靠吗?

影响相关性的因素有文库制备过程的稳定性和细胞状态的一致性。如果相关性较低,可能是由于文库中细胞状态差异较大。可能与细胞检测时的状态有关,有些细胞可能活性降低,核酸存在降解的状态。

Q2. 检测线粒体表达量目的是为了作为阴性对照吗?正常线粒体基因在细胞中含量不是很多,那检测线粒体表达量是评价测序结果好坏的一个阴性对照吗?

检测线粒体基因的表达量是一个数据分析质控指标。除了部分特殊类型的细胞(如卵细胞),如果定位到线粒体的比例高,表明细胞质量较低,这可能是细胞凋亡增加所致。

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